使用Genovis的OpeRATOR圖譜O-聚糖位點對依那西普進行LC-MS分析：依那西普是一種 Fc 融合蛋白，具有高度 O-糖基化的鉸鏈區域。將依那西普與OpeRAT一起孵育，并使用LC-MS/MS分析所得糖肽。促紅xibao生成素 （EPO） 是一種具有單個 O-糖基化位點的 ~30 kDa 糖蛋白。在PNGase F去除N-糖并使用SialEXO進行去唾液酸化后，用OpeRAT消化天然蛋白，并通過反相LC-MS分析所得蛋白質片段。O-糖基化的位點可以通過識別OeRATOR消化位點直接推斷出來。為了獲得良好性能，需要去除唾液酸助劑，因此購買中包括2000個單位（如果SialEXO凍干）。1. 用于方法開發的靈活產品形式；2. 可以結合酶以提高效率；3. 適用于自動化工作流程；4. 即用型 - 只需加水即可。O-聚糖是OpeRATOR活性所必需的，而該酶在N-聚糖上沒有活性。OpeRATOR和SialEXO處理后，O-糖基化蛋白被消化成攜帶O-聚糖的肽。消化發生在O-糖基化位點的N端。OpeRATOR用于質譜法進行O-糖分析、O-糖肽圖譜以及中級分析，消化發生在O-糖基化位點的N端。黑龍江瑞典GenovisPNGaseF去糖基化酶瑞典Genovis

Genovis的ImpaRATOR? 可用于多種 O-聚糖：依那西普是一種融合蛋白，由TNF受體的胞外結構域與人IgG1的Fc部分相連。該蛋白質在Fc區域上方含有多達13個O-糖基化的Ser/Thr殘基簇，使其成為一種非常難以在結構上表征的生物制藥。為了證明ImpaRATOR的聚糖特異性，制備了三種具有不同聚糖組成的依那西普樣品：（i）攜帶單唾液酸和二唾液酸化he心1結構混合物的未經處理的糖蛋白，（ii）用SialEXO處理的糖蛋白去除唾液酸并產生裸核1結構，以及（iii）用SialEXO和GalactEXO處理的糖蛋白產生單個GalNAc殘基， 也稱為Tn抗原。用ImpaRATOR和FabRICATOR在一鍋反應中處理三個樣品（圖1）。作為比較，SialEXO處理的依那西普用OpeRATOR和FabRICATOR處理。將所得肽還原、烷基化并用HILIC-MS進行分析。FabRICATOR被包括在反應中，以將Fc區與大多數C端糖肽分離，以促進其表征。山西瑞典GenovisPNGaseF去糖基化酶蛋白質組學研究并在FabRICATOR消化后使用LC-MS在亞基水平上研究酶活性。TNFR和Fc/2片段分別分析。

OglyZOR 來源于口腔鏈球菌，在大腸桿菌中表達。該酶含有 His 標簽，分子量為 227 kDa。SialEXO來源于Akkermansia muciniphila，在大腸桿菌中表達。SialEXO酶含有His標簽，組分的分子量分別為42 kDa和66 kDa。1.高效O-糖苷酶；2. 降低樣品異質性，揭示潛在的關鍵蛋白質修飾；3. 完全、穩健地去除 O-糖he心 1 二糖。Genovis的凍干酶，用于水解糖蛋白上的he心1 O-聚糖。OglyZOR 凍干劑以凍干粉的形式提供，裝在 2000 個單位的小瓶中，用于在 2 mg 糖蛋白上水解he心 1 O-聚糖。它需要去除唾液酸助劑才能發揮作用，因此與2000單位的SialEXO凍干一起提供。

在Genovis的PNGaseF去除N-聚糖并用SialEXO和GalactEXO截斷O-聚糖后，在質譜圖中觀察到幾個與GalNAcs相關的峰。為了去除剩余的GalNAc殘基，應用GalNAcEXO酶。用GalNAcEXO處理后觀察到的單個蛋白峰顯示完全去除剩余的GalNAcs。?GalNAcEXO在生理緩沖液和中性pH值中具有活性，使其與大多數樣品相容。此外，GalNAcEXO的活性不依賴于任何可能影響LC-MS分析的輔因子，如BSA。根據底物的性質，糖蛋白的GalNAcEXO反應在2小時內完成，而更復雜的樣品可能需要孵育過夜。Genovis的GalNAcEXO也可固定在離心柱中，以便快速方便地處理樣品，在制備過程中不會殘留酶。PNGase F Automation 含有以自動化友好的 96 孔板形式凍干的 PNGase F 酶。

為了研究 OglyZOR 對天然糖蛋白的活性，將該酶與依那西普、TNFR 和阿巴西普在 37°C 下有或沒有 SialEXO 孵育 1 小時。當唾液酸被去除時，OglyZOR酶有效地水解了所有三種底物中的O-聚糖。Genovis的OglyZOR 酶可有效水解天然糖蛋白中的he心 1 二糖 （Gal-β1,3-GalNAc）。這使得這些酶適合在LC-MS分析之前制備樣品，以鑒定其他PTM或確認氨基酸序列O-糖基化生物制藥的全去糖基化：O-糖基化生物制藥（如依那西普）很難表征。為了能夠通過質譜法測定完整質量數，我們進行了酶促總去糖基化。N-聚糖被Genovis的PNGase F裂解，而O-聚糖可以與OglyZOR和SialEXO一起去除。。復雜樣品的特異性凈化；改進 MS 分析的樣品制備。甘肅凍干粉形式PNGaseF去糖基化酶

在天然條件下使用OmniGLYZOR Microspin色譜柱，可在3小時內有效去除C1 抑制劑O-聚糖。黑龍江瑞典GenovisPNGaseF去糖基化酶瑞典Genovis

使用Genovis的GalNAcEXO 對 O-糖基化生物制藥進行 Tn 抗原表征：未成熟的截短O-聚糖導致了復雜生物制藥的異質性，使其分析更具挑戰性。 O-聚糖的he心由n-α-GalNAc殘基組成，通過糖苷鍵與絲氨酸或蘇氨酸連接，稱為Tn抗原。 現在，使用GalNAcEXO可以采用合適的酶策略來去除這些GalNAc并簡化生物制藥的表征。在質譜圖中可以觀察到重復峰的模式。其次，在與GalNAcEXO酶孵育后，剩余的GalNAc殘基被完全去除，留下一個峰。因此，該工作流程確認了 O-糖基化生物制藥上存在 Tn 抗原，并允許定量he心 GalNAc 水平。這種工作流程的另一個好處是減少了剩余的異質性，這有助于確認蛋白質的完整質量，并揭示截短的片段。黑龍江瑞典GenovisPNGaseF去糖基化酶瑞典Genovis