江蘇原料藥熱原檢測家兔法替代方案

來源：發布時間：2025-10-08

PBMC（外周血單個核細胞）用于 MAT 熱原檢測時，存在異質性與血源供應兩大關鍵問題。從異質性來看，PBMC 含 12% 單核細胞與 88% 淋巴細胞，且來自不同供體，細胞組成、功能狀態及熱原反應存在明顯差異，導致熱原刺激后 IL-6 釋放量波動大，標準化難度高。血源供應方面，除受獻血者數量、時間及采集血液政策限制外，EP2.6.30 還要求嚴格檢測乙肝、丙肝等標志物，且采集血液、處理、試劑制備全程需無菌操作，流程環節多、復雜度高，遠不及單核細胞系制備簡便，易影響熱原檢測的時效性與穩定性。保持細胞活性穩定，是實現準確熱原檢測的基礎條件。江蘇原料藥熱原檢測家兔法替代方案

中國藥典對 MAT 法熱原檢測要求 4 復孔，未明確 CV 限值，需結合細胞實驗特性合理解讀與操作。藥典不設 CV 限值的主要原因是：MAT 法基于細胞反應，細胞活性易受環境微小變化（如溫度、pH）影響，存在天然不穩定性，過嚴的 CV 要求可能脫離實際；但實驗室可通過積累多批次數據，制定內部 CV 控制范圍（如定量上下限 CV≤30%、25%），確保檢測重復性。關于 3 復孔的適用性：若長期數據顯示 CV 控制良好（如連續 10 批次 CV<20%），且樣品為中間過程檢測（非 QC 放行），可嘗試 3 復孔，但需同步設置加標對照，驗證結果可靠性；若為 QC 放行檢測，仍建議按 4 復孔操作，符合藥典下限要求。對于異常點處理，可采用狄克遜準則（Q 檢驗）等統計學方法 —— 如某復孔 IL-6 檢測值偏離平均值 30% 以上，且無明顯操作誤差（如加樣錯誤），可判定為異常點并剔除，但需在原始記錄中詳細說明原因，確保數據可追溯，避免隨意剔除導致結果失真。

北京抗體藥物熱原檢測熱原檢測MAT零動物消耗，降低檢測成本，提升檢測效率和倫理水平。

一次合格的 MAT 法熱原檢測，需同時滿足 “合格標曲” 與 “合格樣品檢測值及回收率” 兩大關鍵條件。合格標曲需具備四要素：一是良好線性，采用 4-Parameter Logistic 擬合，R2 需接近 1.0，避免線性不佳導致定量偏差；二是良好信號值，各濃度點 OD 值需呈梯度變化，高濃度點 OD 值需足夠（如上限濃度 OD600 達 1.0 左右），信號過低會影響靈敏度；三是良好 CV，復孔間 CV 需控制在合理范圍（定量限內≤25%、定量上下限≤30%），確保重復性；四是良好背景值，陰性對照 OD 值需低于標曲下限濃度點 10%，排除外源污染。合格樣品檢測值則需滿足加標回收率在 50%-200%，例如文檔中某樣品 10 倍稀釋回收率 41.3%（不合格），20 倍 71.3%（接近合格），40 倍 97.7%（合格），需在 MVD 范圍內調整稀釋倍數，同時樣品熱原濃度需低于規定限值（CLC），方可判定樣品符合要求。

湖州申科生物熱原檢測試劑盒（MAT 法，貨號 1502100）包含完整的檢測體系，組分按功能可分為細胞培養類、ELISA 檢測類與輔助類，且儲存條件明確。細胞培養類組分包括：2-8℃儲存的培養液（25mL×2 瓶）、96 孔細胞孵育板，-18℃儲存的培養液添加劑（1.5mL×1 管）、細菌內毒素工作標準品，以及需液氮保存的 MAT 細胞（2 支），確保細胞活性與穩定性。ELISA 檢測類組分涵蓋：2-8℃儲存的生物素偶聯抗 IL-6 抗體（200×，60μL）、鏈霉親和素 HRP 復合物（100×，140μL）、TMB 顯色液（12mL）、終止液（6mL），以及抗 IL-6 預包被酶標板（8 孔 ×12 條），無需額外制備抗體，即開即用。輔助類組分包括細菌內毒素檢查用水（8mL×1 管）、稀釋液（25mL）、濃縮緩沖液（10×，25mL×2 瓶）與封板膜，滿足從樣品稀釋到檢測終止的全流程需求。各組分儲存條件嚴格區分，避免因儲存不當導致性能下降，保障檢測結果可靠。

MAT 法干擾試驗需設 3 個樣品濃度梯度（A、2A、4A 倍），均不超過MVD且加標回收合格。

MAT法熱原檢測中，ELISA 加終止液后的讀數時間需嚴格控制，以保障 IL-6 檢測信號穩定。湖州申科生物MAT試劑盒說明書明確要求，終止液添加后需在 10 分鐘內完成讀數，且需避光操作 —— 原因在于，終止液（如硫酸）會終止 TMB 顯色反應，但生成的黃色產物在光照下易降解，超過 10 分鐘后 OD 值會下降，導致 IL-6 檢測值偏低。讀數前需進行 30 秒震蕩混勻，確保孔內液體濃度均勻，避免因局部濃度差異導致復孔 OD 值波動。酶標儀波長需設置為 450nm，若儀器含 600nm 參考波長，可同時檢測 600nm 波長以扣除背景干擾（如細胞碎片導致的光散射），提升檢測準確性。需注意的是，讀數時不可覆蓋封板膜或蓋子，避免膜上凝結的水蒸氣滴入孔中，導致 OD 值異常升高。若因儀器故障無法及時讀數，需將微孔板密封后置于 4℃避光保存，并在 30 分鐘內完成讀數，同時在記錄中注明延遲原因，評估延遲對結果的影響（如延遲 20 分鐘，OD 值可能下降 15%，需校正后使用）。

單核細胞系傳代可控，20代以內TLR表達與炎癥因子分泌保持穩定，確保熱原響應一致性。河北熱原檢測技術升級

家兔法熱原試驗雖能篩查所有類別熱原，卻因周期長、成本高、靈敏度低而逐步被體外方法取代。江蘇原料藥熱原檢測家兔法替代方案

傳統細菌內毒素檢查法（BET）只能檢測革蘭氏陰性菌的 LPS，無法識別革蘭氏陽性菌 LTA、真菌酵母多糖、病毒鞭毛蛋白等非內毒素熱原，存在漏檢風險；同時，部分樣品（如脂質體、表面活性劑制劑）會因內毒素吸附導致低內毒素回收（LER），BET法難以準確定量。MAT 法通過單核細胞表面的多種 TLR 受體（TLR1-TLR10），可識別不同類型熱原：TLR4 識別 LPS、TLR2/TLR6 識別 LTA 與酵母多糖、TLR5 識別鞭毛蛋白、TLR3 識別病毒 dsRNA 等，實現 “全熱原覆蓋”。湖州申科生物熱原檢測試劑盒（MAT法）的驗證數據顯示，其對不同濃度非內毒素熱原均有響應：如 0.1-100μg/mL 鞭毛蛋白可檢測到 0.005-0.035EU/mL熱原活性，0.1-10μg/mL LTA 對應 0.1-0.7EU/mL 熱原活性，1-100μg/mL 雷西莫特（TLR7/8 配體）對應 0.5-3.0EU/mL 熱原活性。此外，MAT法檢測的是熱原的生物活性（而非單純 LPS 含量），可避免 LER 導致的假陰性，為CGT等高風險產品提供更有保障的熱原檢測方案。

江蘇原料藥熱原檢測家兔法替代方案

標簽：宿主細胞蛋白（HCP）殘留檢測熱原檢測內毒素檢測宿主細胞殘留DNA檢測支原體檢測

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