MAT法熱原檢測(cè)中，標(biāo)曲信號(hào)值偏低或線性不佳是常見問題，需按細(xì)胞、標(biāo)準(zhǔn)品、ELISA 檢測(cè)三環(huán)節(jié)排查解決。細(xì)胞相關(guān)問題中，細(xì)胞復(fù)蘇后若未充分混勻?qū)е陆Y(jié)團(tuán)，種板后細(xì)胞分布不均，會(huì)使局部信號(hào)弱，需振蕩細(xì)胞懸液后再種板；細(xì)胞活性差或處理時(shí)間超半小時(shí)，會(huì)降低炎癥因子分泌，需嚴(yán)格按說明書操作并縮短處理時(shí)間；孵育未達(dá) 37℃、5% CO?條件，細(xì)胞活化不足，需確保培養(yǎng)箱參數(shù)穩(wěn)定；細(xì)胞懸液若接觸外源熱原，會(huì)引發(fā)非特異性反應(yīng)，操作時(shí)需遠(yuǎn)離熱原污染源。標(biāo)準(zhǔn)品問題方面，配制稀釋錯(cuò)誤會(huì)直接導(dǎo)致濃度不準(zhǔn)，需核對(duì)稀釋步驟；振蕩時(shí)間不足（未按說明書要求）會(huì)使內(nèi)毒素分散不均，需確保振蕩充分且 4 小時(shí)內(nèi)使用；標(biāo)準(zhǔn)品降解會(huì)導(dǎo)致效價(jià)下降，需按推薦條件保存（如 - 20℃冷凍）。ELISA 檢測(cè)環(huán)節(jié)，孵育時(shí)間短或振蕩速度慢會(huì)影響抗體結(jié)合，可適當(dāng)延長(zhǎng)孵育或提高振蕩速度；TMB 顯色不足（<3 分鐘）會(huì)導(dǎo)致信號(hào)低，需顯色 3-10 分鐘，待高濃度點(diǎn) OD600 達(dá) 1.0 時(shí)加終止液。

熱原檢測(cè)MAT法的法規(guī)地位持續(xù)提升，已成為多國(guó)藥典認(rèn)可的熱原檢測(cè)替代方法。歐洲藥典（EP）是推動(dòng) MAT 應(yīng)用的關(guān)鍵力量：通則 2.6.30 明確 MAT 可替代家兔熱原試驗(yàn)（RPT），且能同時(shí)檢測(cè)內(nèi)毒素與非內(nèi)毒素?zé)嵩?024 年歐洲藥典委員會(huì)批準(zhǔn)刪除所有條款中的家兔法，修訂文本將于 2025 年7月1日生效，強(qiáng)制鼓勵(lì)使用 MAT 等體外替代方法。美國(guó)藥典（USP）<151> 規(guī)定，經(jīng)驗(yàn)證的體外熱原試驗(yàn)（如 MAT）可替代家兔法，且需依據(jù) USP<1225>開展驗(yàn)證；FDA 行業(yè)指南進(jìn)一步明確 MAT 的合規(guī)性。中國(guó)藥典 2020 年版通則 9301 將 MAT 列為熱原檢查的補(bǔ)充方法，雖暫未替代家兔法，但明確其適用于復(fù)雜基質(zhì)樣品的全熱原篩查。此外，ISO 10993-1、ICCVAM 等國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)也優(yōu)先推薦體外熱原檢測(cè)模型，全球法規(guī)協(xié)同推動(dòng) MAT 成為熱原檢測(cè)的主流技術(shù)。

在單核細(xì)胞活化試驗(yàn)（MAT）的熱原檢測(cè)中，IL-6 被確定為關(guān)鍵檢測(cè)指標(biāo)，而非 IL-1β 或 TNF-α，主要源于其在穩(wěn)定性、生物學(xué)關(guān)聯(lián)性及商業(yè)化應(yīng)用上的優(yōu)勢(shì)。從穩(wěn)定性來看，IL-6 在體外培養(yǎng)環(huán)境中受個(gè)體免疫狀態(tài)影響較小，半衰期更長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性更優(yōu)，且檢測(cè)靈敏度高，能準(zhǔn)確定量熱原污染水平；而 TNF-α 和 IL-1β 產(chǎn)生時(shí)間短、表達(dá)量低，還易被蛋白酶降解，導(dǎo)致檢測(cè)信號(hào)波動(dòng)大，難以標(biāo)準(zhǔn)化。從生物學(xué)特性而言，IL-6 是先天免疫反應(yīng)的炎癥介質(zhì)，可通過活化 JAK-STAT 和 NF-κB 通路驅(qū)動(dòng)急性期反應(yīng)，如誘導(dǎo)大腦產(chǎn)生前列腺素 E2（PGE2）觸發(fā)發(fā)熱，與熱原的致熱機(jī)制直接關(guān)聯(lián)，是公認(rèn)的發(fā)熱標(biāo)志物。同時(shí)，MAT 法熱原檢測(cè)會(huì)輔以 IL-1β 和 TNF-α 監(jiān)測(cè) ——IL-1β 反映單核細(xì)胞活化程度，TNF-α 提示炎癥放大效應(yīng)，形成多因子協(xié)同體系。此外，IL-6 的 ELISA 試劑盒市場(chǎng)成熟度高、跨平臺(tái)兼容性強(qiáng)，而 IL-1β 和 TNF-α 的檢測(cè)方法在靈敏度和標(biāo)準(zhǔn)化上仍有局限，進(jìn)一步奠定了 IL-6 的重要地位。

PBMC（外周血單個(gè)核細(xì)胞）的供體差異會(huì)直接導(dǎo)致熱原檢測(cè)結(jié)果的波動(dòng)，主要體現(xiàn)在 IL-6 釋放水平的不一致。不同供體的 PBMC，其單核細(xì)胞比例、TLR 受體表達(dá)量、免疫活性狀態(tài)存在差異：有的供體 PBMC 受熱原刺激后， IL-6 釋放量高；有的則極低，甚至無明顯響應(yīng)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示， PBMC 的標(biāo)曲各濃度點(diǎn)相對(duì)偏差有高達(dá) 171.43%的，正是這種差異的體現(xiàn)，導(dǎo)致熱原檢測(cè)結(jié)果難以標(biāo)準(zhǔn)化，無法準(zhǔn)確判斷供試品熱原是否超標(biāo)，從而增加了藥品的質(zhì)量控制風(fēng)險(xiǎn)。

MAT 法熱原檢測(cè)的關(guān)鍵機(jī)制是 “熱原活化單核細(xì)胞 TLR 受體，觸發(fā)炎癥因子分泌”，TLR 受體的全覆蓋是保障檢測(cè)無遺漏的關(guān)鍵。不同熱原需活化不同 TLR 受體：最常見的內(nèi)毒素（LPS）主要活化 TLR4，而革蘭氏陽性菌的非內(nèi)毒素?zé)嵩ㄈ缰妆谒幔┬杌罨?TLR2/6，真菌多糖活化?TLR2/4，病毒核酸活化 TLR3/7/8 等。因此，MAT 試劑盒配套細(xì)胞需具備全覆蓋的 TLR 受體表達(dá)—湖州申科生物通過 Western blot 驗(yàn)證，其 HL-60 細(xì)胞系表達(dá) TLR1-TLR9，可響應(yīng)各類熱原。為進(jìn)一步驗(yàn)證覆蓋能力，申科用不同非內(nèi)毒素?zé)嵩潴w（如脂磷壁酸、酵母多糖）刺激細(xì)胞，結(jié)果顯示所有配體均能誘導(dǎo) IL-6 分泌，且呈良好量效關(guān)系，證明試劑盒可檢出各類熱原。若細(xì)胞 TLR 受體覆蓋不全（如缺失 TLR2），則無法檢測(cè)革蘭氏陽性菌的非內(nèi)毒素?zé)嵩瑢?dǎo)致漏檢風(fēng)險(xiǎn)，因此 TLR 受體的全覆蓋是 MAT 法熱原檢測(cè)的關(guān)鍵技術(shù)指標(biāo)之一。

單核細(xì)胞活化反應(yīng)測(cè)定（MAT）是近年來熱原檢測(cè)領(lǐng)域的突破性技術(shù)，其原理基于人體免疫系統(tǒng)對(duì)熱原的天然應(yīng)答機(jī)制：人源單核細(xì)胞（如 THP-1 細(xì)胞系或新鮮人全血單核細(xì)胞）在熱原刺激下，會(huì)活化胞內(nèi)炎癥信號(hào)通路，釋放 IL-6、TNF-α 等促炎細(xì)胞因子，通過 ELISA 檢測(cè)細(xì)胞因子的濃度，即可間接反映樣品中熱原的總量與活性。與傳統(tǒng)檢測(cè)方法相比，MAT 法具備三大不可替代的優(yōu)勢(shì)：一是廣譜性，可同時(shí)檢測(cè)細(xì)菌內(nèi)毒素、病毒、真菌毒素、支原體等所有類型熱原，填補(bǔ)了鱟試驗(yàn)法只能檢測(cè)內(nèi)毒素的 “非內(nèi)毒素?zé)嵩^(qū)”，尤其適用于疫苗、基因治療產(chǎn)品等易受多種熱原污染的高風(fēng)險(xiǎn)產(chǎn)品；二是人源相關(guān)性，采用與人體同源的細(xì)胞模型，檢測(cè)結(jié)果更貼近臨床實(shí)際熱原反應(yīng)，避免家兔試驗(yàn)中動(dòng)物種屬差異導(dǎo)致的誤判；三是高靈敏度，對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素的檢測(cè)限可達(dá) 0.0125EU/mL，對(duì)非內(nèi)毒素?zé)嵩ㄈ缃湍付嗵恰⑾俨《荆┑臋z測(cè)限低至 ng/pg 級(jí)，滿足低限值產(chǎn)品的質(zhì)控需求。