北京疫苗熱原檢測家兔法替代方案

來源：發布時間：2025-11-11

PyroSHENTEK^®熱原檢測試劑盒（MAT法）已完成 25 個品種樣品的檢測驗證，覆蓋單抗類、疫苗類、基因工程類、血液制品類、生化藥品類與注射液，結果顯示其適配性范圍廣但需關注部分樣品的干擾。疫苗類（如麻腮風聯合減毒活疫苗、人用狂犬病疫苗）、基因工程類（重組人促紅素、干擾素 α-2b）、血液制品類（人血白蛋白、凝血因子 Ⅷ）與注射液（生理鹽水、琥珀酰明膠）的加標回收率均在 50%-200% 范圍內，無明顯干擾，檢測結果可靠。單抗類（如貝伐珠單抗、阿達木單抗）、中藥注射液等樣品雖存在不同程度的抑制作用，需通過提高稀釋倍數（如稀釋至 MVD 上限）、超聲處理或添加中和劑消除抑制，優化后回收率均可達標。此外，MAT 法可有效檢測非內毒素熱原，如對貝伐珠單抗注射液中添加的酵母多糖（Zymosan，200μg/mL）、脂磷壁酸（LTA，10μg/mL），回收率分別達 113%、66.8%，證明其可解決傳統鱟試劑漏檢非內毒素熱原的問題，尤其適用于高風險生物制品的熱原防控。

保持細胞活性穩定，是實現準確熱原檢測的基礎條件。北京疫苗熱原檢測家兔法替代方案

MAT 法熱原檢測標曲采用非倍比稀釋，而非 1-0.5-0.25 的倍比稀釋，主要優勢在于提升標曲準確性與適用性，避免稀釋誤差影響。一是可密集覆蓋關鍵濃度區間：熱原檢測的重點關注區為低濃度拐點（如 0.0125-0.1EU/mL）與高濃度平臺區（如 0.5-1EU/mL），非倍比稀釋可在這些區間設置更多濃度點（如 0.0125、0.025、0.05、0.1、0.25、0.5、1EU/mL），提升曲線擬合精度，而倍比稀釋低濃度點少，易導致低濃度熱原定量不準。二是降低稀釋誤差累積：倍比稀釋需連續稀釋（如 1EU/mL→0.5EU/mL→0.25EU/mL），每一步誤差會累積，導致低濃度點實際濃度偏離理論值；非倍比稀釋通過單獨配制每個濃度點（如直接用標準品配制 0.025EU/mL），避免誤差累積，提升標曲可靠性。三是適配不同樣品濃度：非倍比稀釋可根據樣品預期濃度調整標曲范圍，如樣品預期濃度 0.05EU/mL，可增加 0.025、0.05、0.1EU/mL 點，確保樣品濃度落在標曲線性區，而倍比稀釋范圍固定，靈活性差。這些優勢使非倍比稀釋成為 MAT 法標曲配制的優先選擇方式。

黑龍江重組蛋白熱原檢測細胞因子IL-6因穩定性高、半衰期長，被選為熱原檢測MAT法關鍵定量指標，優于TNF-α與IL-1β。

MAT法熱原檢測中，ELISA 加終止液后的讀數時間需嚴格控制，以保障 IL-6 檢測信號穩定。湖州申科生物MAT試劑盒說明書明確要求，終止液添加后需在 10 分鐘內完成讀數，且需避光操作 —— 原因在于，終止液（如硫酸）會終止 TMB 顯色反應，但生成的黃色產物在光照下易降解，超過 10 分鐘后 OD 值會下降，導致 IL-6 檢測值偏低。讀數前需進行 30 秒震蕩混勻，確保孔內液體濃度均勻，避免因局部濃度差異導致復孔 OD 值波動。酶標儀波長需設置為 450nm，若儀器含 600nm 參考波長，可同時檢測 600nm 波長以扣除背景干擾（如細胞碎片導致的光散射），提升檢測準確性。需注意的是，讀數時不可覆蓋封板膜或蓋子，避免膜上凝結的水蒸氣滴入孔中，導致 OD 值異常升高。若因儀器故障無法及時讀數，需將微孔板密封后置于 4℃避光保存，并在 30 分鐘內完成讀數，同時在記錄中注明延遲原因，評估延遲對結果的影響（如延遲 20 分鐘，OD 值可能下降 15%，需校正后使用）。

家兔熱原試驗作為熱原檢測領域的 “法定傳統方法”，被中國藥典（ChP）、美國藥典（USP）、歐洲藥典（EP）均列為法定檢測項目，其主要優勢在于可通過家兔體溫應答篩查所有類型熱原，尤其適用于無法排除非內毒素熱原污染的高風險產品，如血液制品、放射性質藥物及部分生物制劑。然而，家兔熱原試驗存在明顯局限：動物個體差異大，需額外投入時間與成本篩選合格家兔；檢測周期長（至少 6 小時），無法滿足生物制品快速放行需求；靈敏度較低（對 LPS 檢測限≥5EU/kg），與全球倡導的“動物福利3R原則”背道而馳。

與傳統方法相比，MAT 法能更覆蓋各類熱原，保障產品安全性。

相較于傳統家兔法，熱原檢測MAT法在動物福利、檢測性能、適用范圍等方面具有明顯優勢。從動物福利看，MAT法使用分離培養的單核細胞系（如湖州申科 HL-60 細胞系），無需動物，完全符合 “減少、替代、優化” 的 3R 原則，規避家兔法的倫理爭議與飼養成本。檢測性能上，家兔法只能定性且靈敏度低（檢測限≥5EU/kg），結果受動物個體差異、環境溫度影響大；MAT 法可定量檢測，標曲線性范圍 0.0125-1.0EU/mL，檢測限（LOD）達 0.0125EU/mL，批間 CV≤25%，重復性更優。適用范圍方面，家兔法不適用于放射性質藥物、基因療法制劑等可能影響動物體溫的產品；MAT法適配疫苗、血制品、抗體藥、化藥等幾乎所有類型樣品，且支持高通量檢測，單塊 96 孔板可同時分析多個樣品，檢測時間從家兔法的3-7天縮短至1.5天，大幅提升效率。

MAT 法檢測革蘭氏陽性菌注射劑，需排查非內毒素熱原（如 LTA），避免只測內毒素漏檢。遼寧熱原檢測家兔法替代方案

熱原具有頑強穩定性、耐熱性（180℃/2h才能破壞）、水溶性、濾過性，可穿透常規滅菌屏障。北京疫苗熱原檢測家兔法替代方案

MAT 法熱原檢測的關鍵機制是 “熱原活化單核細胞 TLR 受體，觸發炎癥因子分泌”，TLR 受體的全覆蓋是保障檢測無遺漏的關鍵。不同熱原需活化不同 TLR 受體：最常見的內毒素（LPS）主要活化 TLR4，而革蘭氏陽性菌的非內毒素熱原（如脂磷壁酸）需活化 TLR2/6，真菌多糖活化?TLR2/4，病毒核酸活化 TLR3/7/8 等。因此，MAT 試劑盒配套細胞需具備全覆蓋的 TLR 受體表達—湖州申科生物通過 Western blot 驗證，其 HL-60 細胞系表達 TLR1-TLR9，可響應各類熱原。為進一步驗證覆蓋能力，申科用不同非內毒素熱原配體（如脂磷壁酸、酵母多糖）刺激細胞，結果顯示所有配體均能誘導 IL-6 分泌，且呈良好量效關系，證明試劑盒可檢出各類熱原。若細胞 TLR 受體覆蓋不全（如缺失 TLR2），則無法檢測革蘭氏陽性菌的非內毒素熱原，導致漏檢風險，因此 TLR 受體的全覆蓋是 MAT 法熱原檢測的關鍵技術指標之一。

北京疫苗熱原檢測家兔法替代方案

標簽：熱原檢測宿主細胞殘留DNA檢測宿主細胞蛋白（HCP）殘留檢測內毒素檢測支原體檢測

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